Tugas Bioteknologi (“REKAYASA GENETIKA MENGHASILKAN JAMBU METE YANG UNGGUL”

“REKAYASA GENETIKA MENGHASILKAN JAMBU METE YANG UNGGUL”

Tahapan-tahapan dan Teknik atau metede Bioteknologi dalam pembuatan:

1.      Ekstraksi dan Purifikasi DNA

Protokol yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah prosedur ekstraksi yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1987) berbasis CTAB dengan modifikasi penambahan 1,5% Polivinilpolipirolidon (PVPP). Sampel daun muda segar (Gambar 1) dari jambu mete ditimbang sebanyak 0,5 – 0,7 g, lalu diletakkan dalam cawan porselen steril dan ditambahkan 300 μl buffer ekstraksi CTAB kemudian digerus dengan mortar steril sampai daun lumat.

Daun sampel yang telah lumat dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2 ml, kemudian ditambahkan kembali buffer ekstraksi CTAB sebanyak 300 μl dan divortex selama 2-3 menit. Tahapan selanjutnya dilakukan inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 65ºC selama 15 menit sambil tabung dibolak-balik setiap 5 menit. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak yang ditambahkan ke dalam sampel. Sampel kemudian divortex selama 2-3 menit, selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan

kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 25ºC. Tujuannya untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi penyebab kontaminasi dengan DNA. Supernatan yang telah diperoleh kemudian diambil dan ditambahkan dengan larutan Chloroform:Isolamylalkohol atau Chisam dengan perbandingan 24:1. Penambahan Chisam ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Chloroform merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul lain seperti polisakarida, sehingga diharapkan akan diperoleh supernatan berisi DNA yang bebas kontaminan. Suspensi kemudian divortex sampai rata untuk optimalisasi homogenasi.

Selanjutnya suspensi disentrifugasi padakecepatan 12.000 rpm pada suhu 25ºC selama 10 menit, sehingga diperoleh suspensi dengan tiga lapisan: lapisan atas berwarna hijau jernih, lapisantengah berwarna hijau keruh dan lapisan bawah berupa pelet yang berwarna hijau tua. Supernatanpada lapisan paling atas diambil dan ditambahkandengan 2/3 x volume larutan isopropanol dingin untuk presipitasi DNA. Supernatan yang telah ditambahkan isopropanol kemudian digoyang perlahan-lahan dengan cara membolak-balikkan tabung. Untuk mengendapkan DNA (pelet DNA), larutan disentrifugasi kembali pada kecepatan

12000 rpm pada suhu 4ºC selama 20 menit.

 Endapan DNA dicuci dengan 70% etanol sebanyak 500 μl selama dua kali, disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 12.000 rpm dengan suhu 4ºC, kemudian cairan etanol dibuang dan pelet DNA dikeringanginkan, lalu dilarutkan dalam 50 μL buffer TE (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 7,5) dan ditambahkan 1 μL RNAse A (10 mg/mL) kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit sampai 1 jam. DNA disimpan dalam refrigerator sampai siap digunakan.

2.      Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA

Pengecekan kuantitas dan kualitas DNA hasil isolasi dilakukan untuk melihat konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis gel. Pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang 280. Kemurnian larutan DNA dapat dihitung melalui perbandingan A260 nm dengan A280 nm. Batas kemurnian yang biasa dipakaidalam analisis molekuler pada rasio A260/A280 adalah 1,8 – 2,0 (Sambrook and Russel, 1989). DNA yang sudah diukur konsentrasinya diencerkan sehingga mendapatkan konsentrasi yang seragam untuk digunakan dalam analisis PCR. Selanjutnya dilakukan pengecekan kualitas DNA dengan elektroforesis gel untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA dari kontaminan RNA dan keutuhan DNA hasil isolasi.

3.       Amplifikasi DNA

Reaksi amplifikasi DNA dilakukan menggunakan Mesin PCR (MJ Research tipe PCT-100), dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus 3 menit pada suhu 94ºC, dan diikuti dengan 45 siklus selama 1 menit pada suhu 94ºC (denaturasi), 1 menit pada suhu 37ºC (annealing), 2 menit pada suhu 72ºC (ekstensi). Seluruh produk amplifikasi DNA dilengkapi dengan ekstensi selama 1 menit pada suhu 72ºC. Analisis PCR dilakukan dengan total reaksi 20 μl mengandung 10 ng DNA genomik cetakan, masing-masing dNTP 0,1 μM (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP), masing-masing primer RAPD 0,25 ρmol, enzim Taq DNA polymerase 0,04 unit dalam larutan buffer 1X (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% glycerol, 0,5% Tween 20, 0,5% nonidet P40 dan MgCl2 1.5 mM). Hasil amplifikasi divisualisasikan menggunakan lektroforesis horizontal dengan gel agarose 1,5% (w/v) dalam buffer 1X TAE. Gel agarose kemudian direndam di larutan EtBr, sehingga pola pita dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet. Hasil elektroforesis difoto menggunakan BIO-RAD GelDoc™ EQ..

4.      Pemotongan dengan enzim restriksi

DNA genomik yang telah diisolasi dari daun jambu mete diuji kemampuannya untuk dapat dipotong (digestibility) dengan enzim restriksi. Reaksi pemotongan dilakukan pada suhu 37ºC selama satu malam pada inkubator. Reaksi pemotongan dengan total 20 μl mengandung 5 μg DNA, 2 μl 10x buffer restriksi dan 10 unit enzim EcoRI (Roche). Hasil pemotongan DNA kemudian dicek pada gel agarosa 1% dan divisualisasi pada perangkat BIO-RAD Gel Doc™ EQ.

Deskripsi:

1.      Opjek

Jambu mete (Anacardium occidantale L.) merupakan salah satu tanaman industri yang sangat potensial untuk dikembangkan dengan produk

utamanya berupa biji mete (kacang mete). anaman ini umumnya dikembangkan di daerah dataran rendah yang beriklim kering dan dapat tumbuh pada lahan marjinal atau lahan kritis, sehingga dapat difungsikan juga sebagai tanaman untuk penghijauan dan konservasi.

2.      Aplikasi Ilmu

A.    Mikrobiologi

Mikrobiologi merupakan cabang ilmu biologi yang khusus mempelajari jasad-jasad renik. Mikrobiologi berasal dari bahasa yunani (micros: kecil, bios: hidup, dan logos: pengetahuan) sehingga secara singkat dapat diartikan bahwa mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang makhluk-makhluk hidup yang kecil-kecil. Makhluk-makhluk hidup yang kecil-kecil tersebut disebut juga dengan mikroorganisma, mikrobia, mikroba, jasad renik atau protista.

Beberapa aspek yang dibahas dalam mikrobiologi, anatara lain mengkaji tentang:

a.       Karakteristik sel hidup dan bagaimana mereka melakukan kegiatan.

b.      Karakteristik mikroorganisme, suatu kelompok organisme penting yang mampu hidup bebas, khususnya bakteri.

c.       Keanekaragaman dan evolusi, membahas perihal bagaimana dan mengapa muncul macam-macam mikroorganisme.

d.      Keberadaan mikroorganisme pada tubuh manusia, hewan dan tumbuhan.

e.       Peranan mikrobiologi sebagai dasar ilmu pengetahuan biologi.

f.       Bagaimana memahami karakteristik mikroorganisme dapat membantu dalam memahami proses-proses biologi organisme yang lebih besar termasuk manusia.

Mikroorganisma tidak dapat dipisahkan dengan lingkungan biotik maupun lingkungan abiotik dari suatu ekosistem karena berperan sebagai pengurai. Oleh karena itu organisme yang hidup di dalam tanah berperan aktif dalam proses-proses pembusukan dan mineralisasi. Ada juga mikroorganisme tertentu yang dapat mengikat zat lemas (N) dari udara bebas sehingga dapat menyuburkan tanah.

Mikrobiologi dalam kehidupan telah diterapkan di banyak sekali sektor kehidupan, yang paling mashur adalah di bidang pangan: pembuatan tempe, bir, tape, keju dan lain-lain; di bidang kedokteran: telah banyak dihasilkan berbagai jenis serum dan antibiotika dari mikrobia; di bidang lingkungan mikroba telah menjadi bahasan penting, dan banyak lagi di bidang-bidang lainnya.

B.     Biokimia

Biokimia adalah kimia mahluk hidup. Biokimiawan mempelajari molekul dan reaksi kimia terkatalisis oleh enzim yang berlangsung dalam semua organisme. Biokimia merupakan ilmu yang mempelajari struktur dan fungsi komponen selular, seperti protein, karbohidrat, lipid, asam nukleat, dan biomolekul lainnya. Saat ini biokimia lebih terfokus secara khusus pada kimia reaksi termediasi enzim dan sifat-sifat protein. Saat ini, biokimia metabolisme sel telah banyak dipelajari. Bidang lain dalam biokimia di antaranya sandi genetik (DNA, RNA), sintesis protein, angkutan membran sel, dan transduksi sinyal.

Kebangkitan biokimia diawali dengan penemuan pertama molekul enzim, diastase, pada tahun 1833 oleh Anselme Payen. Tahun 1828, Friedrich Wöhler menerbitkan sebuah buku tentang sintesis urea, yang membuktikan bahwa senyawa organik dapat dibuat secara mandiri. Penemuan ini bertolak belakang dengan pemahaman umum pada waktu itu yang meyakini bahwa senyawa organik hanya bisa dibuat oleh organisme. Istilah biokimia pertama kali dikemukakan pada tahun 1903 oleh Karl Neuber, seorang kimiawan Jerman. Sejak saat itu, biokimia semakin berkembang, terutama sejak pertengahan abad ke-20, dengan ditemukannya teknik-teknik baru seperti kromatografi, difraksi sinar X, elektroforesis, RMI (nuclear magnetic resonance, NMR), pelabelan radioisotop, mikroskop elektron, dan simulasi dinamika molekular. Teknik-teknik ini memungkinkan penemuan dan analisis yang lebih mendalam berbagai molekul dan jalur metabolik sel, seperti glikolisis dan siklus Krebs. Perkembangan ilmu baru seperti bioinformatika juga banyak membantu dalam peramalan dan pemodelan struktur molekul raksasa.

Saat ini, penemuan-penemuan biokimia digunakan di berbagai bidang, mulai dari genetika hingga biologi molekular dan dari pertanian hingga kedokteran. Penerapan biokimia yang pertama kali barangkali adalah dalam pembuatan roti menggunakan khamir, sekitar 5000 tahun yang lalu.

C.    Genetika

Genetika (dari bahasa Yunani γέννω atau genno yang berarti "melahirkan") merupakan cabang biologi yang penting saat ini. Ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pewarisan sifat dan variasi sifat pada organisme maupun suborganisme (seperti virus dan prion). Ada pula yang dengan singkat mengatakan, genetika adalah ilmu tentang gen. Nama "genetika" diperkenalkan oleh William Bateson pada suatu surat pribadi kepada Adam Chadwick dan ia menggunakannya pada Konferensi Internasional tentang Genetika ke-3 pada tahun 1906.

Bidang kajian genetika dimulai dari wilayah molekular hingga populasi (lihat entri biologi). Secara lebih rinci, genetika berusaha menjelaskan:

-          Material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan genetik),

-          Bagaimana informasi itu diekspresikan (ekspresi genetik), dan

-          Bagaimana informasi itu dipindahkan dari satu individu ke individu yang lain (pewarisan genetik).

Meskipun orang biasanya menetapkan genetika dimulai dengan ditemukannya kembali naskah artikel yang ditulis Gregor Mendel pada tahun 1900, sebetulnya kajian genetika sudah dikenal sejak masa prasejarah, seperti domestikasi dan pengembangan trah-trah murni (pemuliaan) ternak dan tanaman. Orang juga sudah mengenal efek persilangan  serta membuat sejumlah prosedur dan peraturan mengenai hal tersebut sejak sebelum genetika berdiri sebagai ilmu yang mandiri. Silsilah tentang penyakit pada keluarga, misalnya, sudah dikaji orang sebelum itu. Kala itu, kajian semacam ini disebut "ilmu pewarisan" atau hereditas.

D.    Biologi Sel

Biologi sel (juga disebut sitologi, dari bahasa Yunani kytos, "wadah") adalah ilmu yang mempelajari sel. Hal yang dipelajari dalam biologi sel mencakup sifat-sifat fisiologis sel seperti struktur dan organel yang terdapat di dalam sel, lingkungan dan antaraksi sel, daur hidup sel, pembelahan sel dan fungsi sel (fisiologi), hingga kematian sel. Hal-hal tersebut dipelajari baik pada skala mikroskopik maupun skala molekular, dan sel biologi meneliti baik organisme bersel tunggal seperti bakteri maupun sel-sel terspesialisasi di dalam organisme multisel seperti manusia.

Pengetahuan akan komposisi dan cara kerja sel merupakan hal mendasar bagi semua bidang ilmu biologi. Pengetahuan akan persamaan dan perbedaan di antara berbagai jenis sel merupakan hal penting khususnya bagi bidang biologi sel dan biologi molekular. Persamaan dan perbedaan mendasar tersebut menimbulkan tema pemersatu, yang memungkinkan prinsip-prinsip yang dipelajari dari suatu sel diekstrapolasikan dan digeneralisasikan pada jenis sel lain. Penelitian biologi sel berkaitan erat dengan genetika, biokimia, biologi molekular, dan biologi perkembangan.

E.     Enzimologi

Enzim adalah biomolekul yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia. Hampir semua enzim merupakan protein. Pada reaksi yang dikatalisasi oleh enzim, molekul awal reaksi disebut sebagai substrat, dan enzim mengubah molekul tersebut menjadi molekul-molekul yang berbeda, disebut produk. Hampir semua proses biologis sel memerlukan enzim agar dapat berlangsung dengan cukup cepat.

Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi dan dengan demikian mempercepat proses reaksi. Percepatan terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap. Sebagai contoh, enzim α-amilase hanya dapat digunakan pada proses perombakan pati menjadi glukosa.

Hal-ihwal yang berkaitan dengan enzim dipelajari dalam enzimologi. Dalam dunia pendidikan tinggi, enzimologi tidak dipelajari tersendiri sebagai satu jurusan tersendiri tetapi sejumlah program studi memberikan mata kuliah ini. Enzimologi terutama dipelajari dalam kedokteran, ilmu pangan, teknologi pengolahan pangan, dan cabang-cabang ilmu pertanian.

F.     Virologi

Virologi ialah cabang biologi yang mempelajari makhluk suborganisme, terutama virus. Dalam perkembangannya, selain virus ditemukan pula viroid dan prion. Kedua kelompok ini saat ini juga masih menjadi bidang kajian virologi.

Virologi memiliki posisi strategis dalam kehidupan dan banyak dipelajari karena bermanfaat bagi industri farmasi dan pestisida. Virologi juga menjadi perhatian pada bidang kedokteran, kedokteran hewan, peternakan, perikanan dan pertanian karena kerugian yang ditimbulkan virus dapat bernilai besar secara ekonomi.

3.      Teknik-teknik

Ø  Ekstraksi dan Purifikasi DNA

Ø  Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA

Ø  Amplifikasi DNA

Ø  Pemotongan dengan enzim restriksi

(Untk lebih jelasnya bisa dilihat diatas)

4.      Agen Hayati

Agrobacterium tumefaciens (Newell etal., 1995; Otani et al., 1998) atau dengan penembakan partikel. Transfer genetik terjadi secara alami pada tanaman dalam merespon organisme patogen. Contohnya, suatu luka dapat terinfeksi oleh bakteri tanah yang disebut Agrobacterium tumefaciens (Agrobacter). Bakteri ini memiliki plasmid yang besar (molekul DNA double helix yang sirkuler) yang dapat merangsang sel-sel tanaman untuk tumbuh terus-menerus tanpa terkontrol (tumor).

5.      Produk

Terlihat bahwa teknik isolasi DNA dengan cara menghilangkan penggunaan nitrogen cair, tanpa penyimpanan sampel jaringan yang akan diisolasi terlebih dahulu serta dengan memodifikasi teknik yang digunakan dapat memberikan hasil DNA yang sangat murni dan pola pita serta fragmentasi yang sangat jelas ketika dilakukan proses PCR dan pemotongan DNA. Hal ini memberikan efek yang sangat signifikan pada pembiayaan dan efektivitas waktu, sehingga proses analisis molekuler bisa lebih hemat dan cepat. Bahkan dapat lebih hemat dari proses isolasi DNA yang pernah dilakukan pada tanaman kemiri sunan, karena ada beberapa pengurangan jumlah bahan kimia.

Dari hasil isolasi DNA melalui teknik dan metode bioteknologi yang telah dilakukan dapat menghasilkan produk Jambu Mete yang lebih berkualitas dan unggul.