Tugas Bioteknologi (Teknik-teknik Bioteknologi, Prinsip Kerja Bioteknologi dan Tahapan Kerja)

NO	TEKNIK-TEKNIK BIOTEKNOLOGI MODEREN & KONVENSIONAL	PRINSIP KERJA	TAHAPAN  KERJA	GAMBAR ALAT
1	Kultur Jaringan	Kultur jaringan mengandung dua prinsip dasar yang jelas, yaitu : a. Bahan tanam yang totipotensi. Konsep dasar ini mutlak ada dalam pelaksanaan kegiatan kultur jaringan karena hanya dengan adanya sifat totipotensi ini sel jaringan organ yang digunakan akan mampu tumbuh dan berkembang sesuai arah dan tujuan budidaya in vitro yang dilakukan. Namun, sifat totipotensi lebih besar dimilki oleh bagian yang masih muda dan banyak dijumpai pada daerah meristem. Bahan tanam yang sementara ini digunakan dalam kegiatan kultur jaringan dan sering terbukti dapat tumbuh dan berkembang adalah: Sel, sel biasanya ditanam dalam bentuk suspensi dengan kepadatan yang telah ditentukan. Protoplast, biasanya juga ditanam dalam bentuk yang telah ditentukan. Jaringan meristem, jaringan yang ditanam biasanya dalam bentuk potongan organ yang terdapat pada derah-daerah pertumbuhan. Kalus, kalus ditanam dalam bentuk massa sel yang belum terdeferensiasi dan biasanya ditanam daam media induksi untuk pertumbuhan kalus. Organ, bahan yang paling umum dalam kegiatan kultur jaringan. b. Budidaya yang terkendali Sifat bahan yang totipotensi saja tidak cukup untuk kesuksesan kegiatan kultur jaringan. Prinsip dasar budidaya yang terkendali ini meliputi : Keadaan media tempat tumbuh Lingkungan yang mempengaruhi Keharusan sterilisasi Teknik kuljar secara in vitro, beberapa syarat sesuai dengan prinsip dasar kuljar yang harus diketahui antara lain : Memilih eksplan yang baik Untuk mendapatkan eksplan yang baik dan mudah tumbuh, dipilih bagian organ yang masih bersifat meristematik Penggunaan medium yang cocok. Media yang biasa digunakan untuk pembuatan kuljar murni adalah PDA. Keadaan yang aseptik. Keadaan yang aseptik ini meliputi sterilisasi eksplan, media, alat-alat, ruang steril dan ruang kultur (entkas / tempat khusus untuk menanam eksplan ke dalam medium). Pengaturan udara yang baik	Pembuatan media. Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar. Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup.
2	Fusi Protoplas	Fusi protoplas merupakan suatu proses alamiah yang terdapat darimulai tanaman tingkat rendah sampai pada tanaman tingkat tinggi. Fusi protoplas merupakan gabungan protoplas dengan protoplas lain dari beberapa spesies, kemudian membentuk sel yang dapat tumbuh menjadi tanaman hibrid. Tujuan fusi protoplas adalah untuk mendapatkan suatu hibrida somatic atau sibrida atau mengatasi kelemahan dari hibrida seksual. Fusi protoplas dapat dimanfaatkan untuk melakukan persilangan antar spesies atau galur tanaman yang tidak memungkinkan untuk dilakukan dengan persilangan biasa karena adanya masalah inkompatibilitas fisik.	1.Mencari prosedur yang tepat untuk isolasi protoplas 2.Mencari prosedur yang tepat untuk mendapatkan hasil fusi yang mempunyai persentase tinggi dalam menghasilkan heterokarion binukleat 3.Seleksi heterokarion setelah fusi 4.Kultur heterokarion dengan persentase pembelahan sel dan regenerasi yang tinggi 5.Analisis karakterhibrid /sibriddan konstitusi genetic dari tanaman yang dihasilkan
3	Fermentasi	1.      Fermentor Merupakantangkiatauwadahdimanadidalamnyaseluruhsel (mikroba) mengubahbahandasarmenjadiprodukbiokimia. 2.      Formulasi Medium. Digunakanuntukmenumbuhkanmikroorganismepada proses produksi. 3.      Inokulum Merupakankomposisi medium strater (growth factor).	Berlangsungdalamkondisi anaerobic atautanpaadanyaoksigen. Proses iniawalnyamenyerupai proses glikolisisdimanaglukosadipecahmenjadiAsamPiruvat, ATP dan NADH. Selanjutnya NADH kembaliteroksidasimenghasilkan CO2danprodukakhir yang berupa alcohol atauasam, tergantungpadaorganisme yang melakukan proses fermentasi.
4	Isolasi DNA	Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik  sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan  mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan.	1.      Isolasi sel Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan. 2.      Lisis dinding dan membran sel Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan  larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi. 3.      Ekstraksi dalam larutan Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak. 4.      Purifikasi Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. 5.      Presipitasi Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas ( Fauziah, 2010)
5	Elektroforesis	Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat molekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.  Molekul yang digunakan dalam praktikum elektroforesis adalah molekul DNA yang bermuatan negatif.  Molekul akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya.  Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) DNA memiliki muatan negatif karena mengandung gugus O. Oleh karena itu, arah migrasi DNA adalah dari kutub negatif ke kutub positif (Kusuma 2010 : 11)	Langkah pertama yaitu membuat gel agarose. Gel agarose dapat dibuat dengan menambahkan 1 gram bubuk agarose ke dalam 100 ml TAE pada tabung erlenmeyer. Setelah itu, dimasukkan ke dalam microwave selama 60 detik. Gel dituangkan ke dalam cetakan dan ditunggu sampai mengeras. Setelah mengeras, gel ditempatkan pada chamber. Langkah kedua yaitu loading sampel ke dalam gel. Loading buffer dibuat dengan komposisi sukrosa, EDTA, dan bromfenol biru. Komposisi tersebut dihomogenisasi dengan melakukan ...... di atas parafilm. Setelah loading buffer berhasil dibuat, ke dalam loading buffer tersebut ditambahkan DNA. Selanjutnya, campuran tersebut dimasukkan ke dalam wells. Langkah ketiga yaitu running buffer. Penutup chamber dipasang kemudian sambungkan ke power supply. Setelah 30 - 40 menit, alat dimatikan  dan gel dikeluarkan dari chamber. Langkah keempat yaitu dokumentasi gel. Gel diamati dalam Gel – Doc sehingga ukuran DNA dapat diketahui. Selanjutnya, DNA hasil elektroforesis di analisis menggunakan DNA marker.
6	PCR	Prinsip kerja dari PCR adalah menggandakan segmen DNA tertentu dengan memanfaatkan enzim sebagai penginisiasi replikasi (Roche diagnostics 2006 : 9).	Denaturasi, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal melalui pemanasan pada temperatur 94-96 °C selama 30-60 detik. Annealing atau Penempelan, yaitu hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA pada suhu 45-60 °C. 3.   Ekstensi/elongasi, yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polymerase pada suhu 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya.
7	Sekuensing DNA	Molekul DNA rekombinan yang memperlihatkan hasil positif dalam reaksi hibridisasi dengan fragmen pelacak sangat diduga sebagai molekul yang membawa fragmen sisipan atau bahkan gen yang diinginkan. Namun, hal ini masih memerlukan analisis lebih lanjut untuk memastikan bahwa fragmen tersebut benar-benar sesuai dengan tujuan kloning. Analisis antara lain dapat dilakukan atas dasar urutan (sekuens) basa fragmen sisipan. Penentuan urutan (sekuensing) basa DNA pada prinsipnya melibatkan produksi seperangkat molekul/fragmen DNA yang berbeda-beda ukurannya tetapi salah satu ujungnya selalu sama. Selanjutnya, fragmen-fragmen ini dimigrasikan/dipisahkan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid atau polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) agar pembacaan sekuens dapat dilakukan. Di bawah ini akan diuraikan sekilas dua macam metode sekuensing DNA.	1. Tahapan sekuensing yang pertama adalah menyediakan dsDNA (double strand DNA) 2. Memotong dsDNA (double strand DNA) menjadi ssDNA (single strand DNA) 3. Mengambil template (cetakan) DNA dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA tadi 4. Menyediakan seluruh alat dan bahan untuk sekuensing DNA. Bahan untuk sekuensing adalah template (cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym polymerase. Template DNA berfungsi sebagai cetakan.  Primer berfungsi sebagai landasan/pijakan yang mengenal situs spesifik pada DNA template untuk memulai prooses polymerase.  dNTP (deoksi nukleotida tri phospat) berfungsi sebagai sumber nukleotida pada proses polymerase sekuensing. dNTP ada 5 jenis, yaitu dATP (deoksi adenin tri phospat), dGTP (deoksi guanin tri phospat), dUTP (deoksi urasil tri phospat), dCTP (deoksi citosin tri phospat), dan dTTP (deoksi timin tri phospat). ddNTP (dideoksi nukleotida tri phospat) berfungsi untuk menghentikan/terminasi proses enzim polymerase, sehingga proses perbanyakan nukleotida terhenti. Enzym polymerase berfungsi untuk reaksi polimerisasi atau perbanyakan nukleotida. 5. Menyiapkan 4 tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi diberikan ddNTP, yaitu ddGTP, ddCTP, ddATP, dan ddTTP. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan ddNTP yang berbeda. Tabung pertama diisi dengan ddGTP, tabung kedua diisi dengan ddCTP, tabung ketiga diisi dengan ddATP, dan tabung keempat diisi dengan ddTTP. 6. Setelah masing-masing tabung diisi dengan ddNTP, kemudian masing-masing tabung diisi dengan dNTP, sebagai sumber nukleotida pada proses polimerasi. Yaitu dGTP, dCTP, dATP, dan dTTP. 7. Memasukkan dNTP ke dalam tabung reaksi tadi. 8. Kemudian memasukkan primer ke dalam tabung reaksi. Primer berfungsi mengenali situs spesifik pada DNA template, juga berfungsi sebagai landasan/pijakan untuk memulai polimerisasi. 9. Setelah pemberian primer, juga dimasukkan enzim polimerase (taq-polymerase). Enzim polimerase memulai proses polimerisasi 10. Enzim polymerase terus mengkatalisis pembentukan polinukleotida dari nukleotida dNTP (deoksi nukleotida tri phospat) 11. Pada saat enzim taq-polymerase mengkatalisis pembentukan ikatan antara nukleotida, deoksi-nukleotida (ddNTP) hadir berikatan dengan polimer nukleotida sebelumnya 13. Kehadiran ddNTP (deoksinukleotida) mengakibatkan terhentinya/terminasi proses polimerase, sehingga dihasilkan rantai polinukleotida yang berbeda panjangnya a). Berikut ini gambar perbedaan struktur dNTP (deoksinukleotida tri phospat) dan ddNTP (dideoksinukleotida tri phospat). b). Keberadaan ddNTP menghalangi terbentuknya ikatan phospodiester antara satu nukleotida dengan nukleotida berikutnya, sehingga mengakibatkan terminasi/pengakhiran proses polimerisasi 14. Kehadiran ddNTP menghasilkan beberapa rantai polinukleotida berbeda 15. Kegiatan nomor 9 sampai nomor 13 dilakukan pada semua tabung reaksi 16. Keempat tabung reaksi tersebut dipersiapkan untuk di alirkan pada gel agarosa 17. Perbedaan panjang polinukleotida tersebut, mengakibatkan perbedaan letak pada gel agarosa. Polinukleotida yang paling pendek bermigrasi/pergerakannya apling cepat pada gel agarosa. 18. Hasil pembacaan sekeuensing dari arah 5’ ke 3’ adalah rantai kompemen, yaitu 5’ AGCCGATCC 3’. Sehingga DNA templatenya adalah 5’ GGATCGGCT 3’
8	Teknik Potong Daun	Teknik Potongan Daun (Leaf Fragment Technique) Transfer genetik terjadi secara alami pada tanaman dalam merespon organisme patogen. Contohnya, suatu luka dapat terinfeksi oleh bakteri tanah yang disebut Agrobacterium tumefaciens (Agrobacter). Bakteri ini memiliki plasmid yang besar (molekul DNA double helix yang sirkuler) yang dapat merangsang sel-sel tanaman untuk tumbuh terus-menerus tanpa terkontrol (tumor). Oleh karena itu, plasmid ini dikenal sebagai Tumor inducing (Ti) plasmid. Sedangkan hasil dari tumor tersebut disebut crown gall. Selama infeksi, bakteri ini mentransfer sebagian kecil materio genetik yang dimilikinya (T-DNA) ke dalam genom sel tanaman inang. Setelah diinsersi, gen-gen bakteri tersebut diekspresi oleh sel-sel tanaman yang terinfeksi.	Dalam teknik ini daun dipotong kecil-kecil kemudian ketika potongan daun mulai regenerasi, selanjutnya akan dikultur pada medium yang mengandung Agrobacter yang telah mengalami modifikasi genetik. Selama proses ini, DNA dan Ti plasmid berintegrasi ke DNA sel inang dan materi genetik pun telah terkirim. Potongan daun tersebut kemudian diberi hormon untuk merangsang pertumbuhan tunas dan akar. Tanaman dikotil seperti tomat, kentang, apel, juga kedelai merupakan contoh yang cocok untuk proses ini. Namun penelitian baru-baru ini jelas menunjukkan bahwa T-DNA dapat digabungkan ke dalam spesies monokotil. Untuk bakteri yang tahan terhadap Agrobacter dilakukan dengan menggunakan pistol gen, yaitu dengan cara menembakkan logam kecil yang diselubungi DNA ke embrio sel tumbuhan, di sini inti sel tumbuhan tetap bisa membidik kloroplas.
9	RFLP	Metode ini dapat digunakan untuk menganalisa secara molekuler keragaman genetik diantara individu dalam suatu populasi. Selain itu teknik ini mempunyai spesifitas sampai tingkat inter spesies dimana adanya mutasi pada daerah non coding DNA menyebabkan perbedaan tempat pemotongan oleh enzim tersebut dapat dipisahkan melalui elektroforesis gel agarosa.	1.      Isolasi DNA Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti, dan dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain. Pada saat melakukannya harus dijaga agar DNA tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang. Proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. Untuk membantu terjadinya lisis biasanya dilakukan inkubasi pada suhu sekitar 60oC. Dalam proses ini biasa digunakan senyawa senyawa phenol, chloroform dan isoamyl alcohol untuk memaksimalkan proses lisis. Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain, termasuk debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi. Kontaminan yang umum ditemukan adalah polisakarida yang dapat mengganggu proses PCR dengan cara menghambat aktivitas Taq polymerase, atau poliphenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA secara kovalen. Untuk menghindarkan hal ini jaringan yang digunakan dijaga tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi. Selain itu dilakukan penambahan antioksidan seperti PVP. Setelah dilakukan ekstraksi dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan ethanol atau isopropanol. Selain DNA semua bahan yang lain kan larut dalam ethanol dingin. Sehingga saat dilakukan sentrifugasi DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa/bahan lain. Sebagai bahan untuk RFLP harus digunakan DNA yang bersih dari kontaminan (mempunyai kemurnian tinggi) dan dengan berat molekul yang tinggi. Selama proses ekstraksi DNA beberapa hal yang dapat terjadi adalah : - DNA patah-patah selama proses isolasi - DNA terdegradasi oleh enzim nuclease - Terjadi kontaminasi oleh polisakarida - Metabolit sekunder ikut terisolasi 2.      Pemotongan dengan enzim restriksi (digesti restriksi) dan elektroforesis gel. DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan enzim restriksi tertentu yang dipilih dengan hati-hati. Setiap enzim restriksi pada kondisi yang sesuai akan mengenali dan memotong DNA sehingga dihasilkan fragmen-fragmen DNA. Fragmen-fragmen tersebut selanjutnya dielektroforesis pada gel agarosa. Karena fragmen-fragmen tersebut tidak akan terlihat sebagai smear berkesinambungan bila diwarnai dengan ethidium bromide, maka pewarnaan saja umumnya tidak dapat mendeteksi adanya polimorfisme. Dengan demikian perlu dilakukan hibridisasi dan visualisasi untuk mendeteksi fragmen tertentu. Hibridisasi dan visuali sasi dilakukan dengan Southern blotting. 3.      Transfer DNA dengan Southern blotting Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarose ke nilon berpori atau membrane nitroselulosa. Transfer DNA disebut ‘Southern blotting’, mengacu kepada nama penemu teknik tersebut yaitu E.M. Southern (1975). Pada metode ini mula-mula gel didenaturasi dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan. Selanjutnya di atas gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori atau membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya diberi pemberat. Semua fragment hasil pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal. Pola fragmen akan sama dengan yang berada pada gel. 4.  Hibridisasi DNA   DNA yang ditransfer pada nilon berpori atau membrane nitroselulosa selanjutnya dihibridisasi dengan probe. Membran diinkubasi bersama probe DNA. Bila antara probe dan DNA target merupakan komplemen maka akan terjadi hibridisasi. Bila probe yang digunakan dilabeli maka selanjutnya dupleks yang terjadi dapat dideteksi. Bila kondisi hibridisasi yang digunakan mempunyai stringency yang tinggi (highly stringent), maka tidak akan terjadi hibridisasi dengan DNA yang mempunyai kekerabatan yang jauh atau non homolog. Jadi probe DNA akan mengenali hanya sekuen yang komplemen dan secara ideal homolog diantara beribu-ribu atau bahakan berjuta-juta fragmen yang bermigrasi sepanjang gel. Fragmen yang diinginkan dapat dideteksi setelah dilakukan pemaparan membrane yang telah mengalami hibridisasi pada film.
10	Pistol Gen	Teknik modern lain dalam transformasi tanaman adalah penggunaan metoda gene gun atau “pistol gen”. Metode transfer gen ini dioperasikan secara fisik dengan menembakkan partikel DNA-coated langsung ke sel atau jaringan tanaman. Pistol gen khusus digunakan untuk menembakkan DNA ke dalam inti sel tumbuhan, tetapi mereka juga bisa membidik kloroplas, yaitu bagian sel yang mengandung klorofil. Tumbuhan memiliki 10-100 kloroplas pada tiap selnya dan setiap kloroplas masing-masing mempunyai ikatan DNA. Apakah target mereka inti sel ataukah kloroplas, peneliti harus mengidentifikasi sel yang dimasuki DNA baru terlebih dahulu. Setelah menggunakan pistol gen, peneliti mengumpulkan sel dan mecoba menumbuhkan meraka di dalam medium yang mengandung antiobiotik. Senapan gen digunakan untuk menembakkan DNA ke dalam nucleus sel tumbuhan, tapi juga dapat ditembakkan ke kloroplas. Sebelum dilakukan penembakan DNA, terlebih dahulu harus ditambahkan marker (berupa gen yang resisten terhadap antibiotik) yang berfungsi sebagai gen penanda/reporter. Setelah insersi gen menggunakansenapan gen, selanjutnya dilakukan screening sel dengan menumbuhkan sel transgenic pada medium yang mengandung antibiotik, sehingga hanya sel tumbuhan tertransformasi yang akan tumbuh.	Metode transfer gen ini dioperasikan secara fisik dengan menembakkan partikel DNA-coated langsung ke sel atau jaringan tanaman. Dengan cara partikel dan DNA yang ditambahkan menembus dinding sel dan membran, kemudian DNA melarut dan tersebar dalam secara independen. Telah didemonstasikan bahwa teknik ini efektif untuk metransfer gen pada bermacam–macam eksplan. Penggunaan particle bombardment membuka peluang dan kemungkinan lebih muda dalam memproduksi tanaman transgenik dari berbagai spesies yang sebelumnya sukar ditransformasi dengan Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil seperti padi, dan jagung.
11	Kloning Gen	Kloning merupakan sel atau kumpulan sel yang identik secara genetik dengan sel atau kumpulan sel yang lain. Penggandaan embrio merupakan langkah yang paling awal dalam kloning. Erksperimen pertama yang pernah sukses adalah memproduksi dua anak domba yang benar-benar mirip. Prosedur ini umum dipraktikkan di industri peternakan sehingga dapat memberikan keuntungan berupa keturunan yang sama dengan ternak unggulan. Prinsip dari Kloning: 1.      Penyediaan DNA sisipan dan vector 2.      Ligasi adalah penggabungan dna sisipan dan vector 3.      Transformasi adalah perbanyakan di sel inang 4.      Seleksi terhadap sel mengandung plasmid 5.       Deteksi pada keberadaan DNA sisipan, kebenaran DNA sisipan (ukuran dan urutan nukleotida) Dengan elektroforesis dan sekuensing.	1.      Memindahkan atau mengambil sel telur 2.      Mengambil DNA sel telur sehingga tinggal sitoplasma (enucleasi) 3.      Mentransfer DNA sel donor (fase G1) yang telah dikultur ke dalam sel telur yang tinggal sitoplasma 4.      Dengan kejutan listrik akhirnya sel dan telur tadi melebur atau bergabung 5.      Sel merespon dan berkembang menjadi embrio, dan ditumbuhkan dalam kultur incubator selama beberapa hari 6.      Setelah embrio siap maka embrio tersebut ditransfer ke induk pengganti, embrio akan berkembang dan akhirnya terbentuk dolly yang sesuai/identik dengan gen pendonor.
12	Hibridoma	Teknik hibridomaadalah teknik pembuatan sel yang dihasilkan dari fusi (penggabungan) antara sel B limfosit dengan sel kanker (jenis mieloma NS-1). Sifat dari sel hibridoma ini adalah immortal (sel abadi karena mampu bertahan hidup, membelah dan memperbanyak diri dalam jumlah tak terbatas dalam media kultur)	1. Proses imunisasi dengan menggunakan antigen  tertentu yang disuntikan ke dalam tubuh  mencit (Mus musculus)*  2. Sel B-limfosit mencit akan merespon antigen sehingga terbentuk antibodi  3  Pemisahan  sel B-limfosit yang sudah mengandung antibodi dari organ limpa mencit 4. Sel B-limfosit kemudian  difusikan dengan sel kanker immortal menghasilkan sel hibridoma 5. Fusi sel hibridoma ini dilakukan dengan membuat membran sel menjadi lebih permeabel sehingga kedua sel bisa menyatu 6. Sel hibridoma kemudian diklon pada kultur sel sehingga dihasilkan banyak sel yangmemiliki anti bodi tertentu sehingga dikenal dengan antibodi monoklonal yang bisadisimpan lama dalam keadaan dibekukan.
13	Transfer Embrio	Transfer embrio adalah suatu proses dimana embrio dipindahkan dari seekor hewan betina yang bertindak sebagai donor pada waktu embrio tersebut belum mengalami implantasi, kepada seekor betina yang bertindak sebagai penerima sehingga resepien tersebut menjadi bunting (Hartantyo, 1987 dalam Yudi, 2009). Teknologi TE merupakan generasi kedua bioteknologi reproduksi setelah inseminasi buatan (IB). Pada prinsipnya teknik TE adalah rekayasa fungsi alat reproduksi dengan hormon superovulasi sehingga diperoleh ovulasi sel telur dalam jumlah besar. Sel telur hasil superovulasi ini akan dibuahi oleh spermatozoa unggul melalui teknik IB sehingga terbentuk embrio yang unggul. Embrio yang diperoleh dari ternak, dikoleksi dan dievaluasi, kemudian ditransfer ke induk resipien sampai terjadi kelahiran.	1.      Metode sinkronisasi birahi  dan superovulasi Sinkronisasi birahi pada ternak resipien harus dilaksanakan pada hari yang sama  pada semua ternak. Sinkronisasi birahi dapat dilakukan dengan beberapa cara,  namun untuk keperluan transfer embrio pada umumnya menggunakan prostaglandin ( PGF2α ). Aplikasi teknik PGF2α dapat  dilakukan dengan cara intramuscular, submukosa vulva atau secara intrauterine. Sinkronisasi birahi dalam rangka transfer embrio sebaiknya dilakukan secara intra uterin dengan teknik rektovaginal. Alat untuk mendepositkan PGF2α  menggunakan kateter intrauterine atau plastic sheet AI Gun yang kemudian dimasukkan ke dalam uterus melalui vagina dipandu dengan tangan per rectal. Superovulasi pada ternak donor dilaksanakan secara bersamaan dengan sinkronisasi birahi pada ternak resipien. Superovulasi dapat dilakukan dengan penyuntikan hormone PMSG dan HCG atau hormone FSH dan LH, dengan tujuan agar menghasilkan embrio dalam jumlah banyak. 2.      Flushing embrio Flushing pada proses transfer embrio adalah membilas uterus ternak donor dengan cara memasukkan cairan media ke dalam koruna uteri kemudian mengeluarkannya kembali untuk mendapatkan embrionya. Teknik flushing dapat dilakukan dengan atau tanpa pembedahan. Teknik yang lebih aman dan lebih banyak digunakan adalah teknik tanpa pembedahan menggunakan foley catheter. Teknik ini dilakukan pada hari ke 5 – 8 yaitu ketika embrio hasil superovulasi sudah berada di koruna uteri namun belum mengalami implantasi. 3.      Pengolahan embrio Embrio yang diperoleh dari hasil flushing uterus ternak donor dapat langsung di transfer dalam bentuk embrio segar kepada ternak resipien atau disimpan dalam bentuk embrio beku untuk ditransfer kepada ternak resipien dikemudian hari. Sebelum ditransfer kepada ternak resipien, embrio hasil flushing terlebih dahulu melewati tahapan berikut : ·         Identifikasi Embrio yang berada didalam media flushing harus dapat di identifikasi terlebih dahulu agar tidak dikelirukan dengan sel epithel tuba fallopii. Proses ini dilakukan dengan menggunakan mikroskop disekting pada pembesaran 25 -40 kali. Embrio stadium morula dini atau blastosis dengan kualitas excellent dan good layak dipergunakan untuk transfer embrio. ·         Pencucian Apabila embrio segera ditransfer maka terlebih dahulu dicuci dalam media transfer dengan cara memindahkannya dari cawan petri ke petri lain sebanyak 3 kali, pengambilan embrio menggunakan pipet mikro atau pipet berkanula, proses ini dilakukan di bawah mikroskop disekting. ·         Pengisian straw Embrio dimasukkan ke dalam straw bening dengan posisi :  MEDIA – UDARA -  MEDIA EMBRIO – UDARA – MEDIA
14	Kriopservasi Embrio	Kriopservasi Embrio di lakukan dengan jalan pembekuan semen dan embrio yang di lakukan untuk konservasi khusunya hewan yang akan punah.	Dilakukan dengan menggunakan Tehnik “Vitrifikasi” yaitu tehnik yang menggunakan zat krioprotektan dengan berat molekul yang besar untuk pembekuan tanpa merusak sel yang dibekukan (mencegah kristalisasi cairan sel). Penyimpanan jangka panjang dengan menggunakan cairan nitrogen.
15	Pembuahan Buatan	Pembuahan buatan dilakukan karena adanya infertilitas (suatu ketidak suburan pada system reproduksi)	Di lakukan dengan mengambil Oosit yang belum matang dari ternak hidup (ovarium dari ternak yang dipotong) kemudian dibuahi di. Lab. Selanjutnya di implantasikan kedalam ternak resipien atau dibekukan untuk ditransper kemudian. Dikenal istilah IVF (In-vitro fertilitation) dan sangat berguna dalam menghasilkan embrio dari ternak yang unggul
16	Transgenesis Perantara oleh Vektor Virus	Banyak metode yang dapat digunakan untuk memasukkan materi genetik baru pada binatang	Retrovirus sebagai perantara transgenesis dapat dilakukan dengan menginjeksikan embrio dari tikus dengan retrovirus sebelum embrio diimplantasikan. Retrovirus sebagai pembawa DNA baru. Metode ini memiliki keterbatasan  pada aplikasinya karena ukuran dari transgen yang terbatas, dan marteri genetik dari virus mungkin akan mempengaruhi proses sehinga membuat transgenik gagal. Vektor plasmid bakteri tidak dapat diaplikasian semuanya pada biteknologi. Ada batasan-batasan agar plasmid dapat digunakan dalam cloning. Satu batas primer adalah  ukuran dari fragmen DNA yang tidak dapat disisipkan pada plasmid. Ukuran sisipan biasanya tidak dapat mencapai 6-7 kilobase (1 kilobase = 1000 bp). Dengan kata lain, beberapa bakteria mengekspresikan protein dari gen eukariotik sedikit sekali. Sebagai hasil pembatasan ini, ahli biologi molecular telah bekerja untuk mengembangkan berbagai tipe vector DNA, yang masing-masing memiliki bagian-bagian yang penting tergantung pada aplikasi dari kloning itu.
17	Insiminasi Buatan	Inseminasi buatan adalah proses memasukkan sperma ke dalam saluran reproduksi betina agar betina dapat mengalami pembuahan (hamil) tanpa terjadinya perkawinan secara alami. Teknologi ini dikembangkan dengan dasar bahwa seekor pejantan secara alamiah mampu memproduksi puluhan milyar spermatozoa per hari, sedangkan hanya diperlukan satu spermatozoa untuk membuahi satu sel telur. Potensi terpendam yang dimiliki seekor pejantan sebagai sumber informasi genetik, apalagi yang unggul dapat dimanfaatkan secara efisien untuk membuahi banyak betina (Hafez, 1993 dalam Sugoro 2009). Tujuan dari IB itu sendiri adalah sebagai satu alat yang ampuh yang diciptakan manusia untuk meningkatkan populasi dan produksi ternak secara kuantitatif dan kualitatif (Toelihere, 1985 dalam Sugoro, 2009).	Teknik inseminasi buatan pada domba Urutan kegiatan inseminasi buatan sebagai berikut: a.       Mengambil sperma yang terencerkan sesuai dengan kebutuhan. b.      Mengambil jarum pada syringe dan mengganti straw dengan yang masih utuh dan bersih. c.       Memasukkan sperma yang terencerkan pada syringe sehingga penuh. d.      Bila birahi kambing atau domba betina tampak nyata, straw dapat langsung dimasukkan secara pelan sesuai dengan kontraksi-relaksasi otot pada vagina menuju pangkal servic. Kemudian, menekan tuas syringe sehingga semua sperma menyembur ke  pangkal vagina atau ujung servic. e.       Menarik keluar straw dengan hati-hati. f.       Menunggu sekitar 2 minggu, lalu melakukan tes kehamilan. (Mulyono, 2002) Gambar 1. Teknik IB dan hasil radiografi (Senger, 2003 dalam Sugoro, 200
18	Secching Semen	Pemisahan sperma yang mengandung kromosom X dari Y. Ini berguna dalam kaitanya penetuan jenis kelamin ternak, yang tentu berpengaruh nilai tambah terhadap nilai produksi.	a.       Fertilisasi eksternal (khas pada hewan-hewan akuatik): gamet-gametnya dikeluarkan dari dalam tubuhnya sebelum fertilisasi. b.      Fertilisasi internal (khas untuk adaptasi dengan kehidupan di darat): sperma dimasukkan ke dalam daerah reproduksi betina yang kemudian disusul dengan fertilisasi. Setelah pembuahan, telur itu membentuk membran fertilisasi untuk merintangi pemasukan sperma lebih lanjut. Kadang-kadang sperma itu diperlukan hanya untuk mengaktivasi telur.
19	Fitoremediasi	Fitoremediasi adalah pengobatan masalah lingkungan (bioremediasi) melalui penggunaan tanaman yang mengurangi masalah lingkungan tanpa perlu menggali bahan kontaminan dan membuangnya di tempat lain.	a.       Phytoacumulation (phytoextraction) yaitu proses tumbuhan menarik zat kontaminan dari media sehingga berakumulasi disekitar akar tumbuhan. Proses ini disebut juga Hyperacumulation. b.      Rhizofiltration (rhizo= akar) adalah proses adsorpsi atau pengedapan zat kontaminan oleh akar untuk menempel pada akar. Percobaan untuk proses ini dilakukan denga menanam bunga matahari pada kolam mengandung radio aktif untuk suatu test di Chernobyl, Ukraina. c.       Phytostabilization yaitu penempelan zat-zat contaminan tertentu pada akar yang tidak mungkin terserap kedalam batang tumbuhan. Zat-zat tersebut menempel erat (stabil) pada akar sehingga tidak akan terbawa oleh aliran air dalam media. d.      Rhyzodegradetion disebut juga enhenced rhezosphere biodegradation, or plentedassisted bioremidiation degradation, yaitu penguraian zat-zat kontaminan oleh aktivitas microba yang berada disekitar akar tumbuhan. Misalnya ragi, fungi dan bacteri. e.      Phytodegradation (phyto transformation) yaitu proses yang dilakukan tumbuhan untuk menguraikan zat kontaminan yang mempunyai rantai molekul yang kompleks menjadi bahan yang tidak berbahaya dengan dengan susunan molekul yang lebih sederhana yang dapat berguna bagi pertumbuhan tumbuhan itu sendiri. Proses ini dapat berlangsung pada daun , batang, akar atau diluar sekitar akar dengan bantuan enzyme yang dikeluarkan oleh tumbuhan itu sendiri. Beberapa tumbuhan mengeluarkan enzym berupa bahan kimia yang mempercepat proses proses degradasi. f.        Phytovolatization yaitu proses menarik dan transpirasi zat contaminan oleh tumbuhan dalam bentuk yang telah larutan terurai sebagai bahan yang tidak berbahaya lagi untuk selanjutnya di uapkan ke admosfir. Beberapa tumbuhan dapat menguapkan air 200 sampai dengan 1000 liter perhari untuk setiap batang. Jenis-jenis tanaman yang sering digunakan di Fitoremediasi adalah: Anturium Merah/ Kuning, Alamanda Kuning/ Ungu, Akar Wangi, Bambu Air, Cana Presiden Merah/Kuning/ Putih, Dahlia, Dracenia Merah/ Hijau, Heleconia Kuning/ Merah, Jaka, Keladi Loreng/Sente/ Hitam, Kenyeri Merah/ Putih, Lotus Kuning/ Merah, OnjeMerah, Pacing Merah/ Mutih, Padi-padian, Papirus, Pisang Mas, Ponaderia, Sempol Merah/Putih, Spider Lili, dll.
20	Pronuklead Mikrogensi	Metode Pronuclear Microinjection adalah memasukkan  DNA transgen pada kemungkinan yang paling awal dari tahap perkembangan zigot (telur yang telah dibuahi).	Metode Pronuclear Microinjection adalah memasukkan  DNA transgen pada kemungkinan yang paling awal dari tahap perkembangan zigot (telur yang telah dibuahi). Ketika sperma dan sel telur bergabung, DNA diinjeksikan secara langsung pada salah satu inti, sperma atau sel telur. Karena DNA baru diinjeksikan secara langsung, maka tidak ada vektor/pembawa yang dibutuhkan, sehingga tidak ada gen eksternal yang mengganggu proses.
21	Embrio Sel Batang	Sel induk ini diambil dari embrio pada fase blastosit (5-7 hari setelah pembuahan). Massa sel bagian dalam mengelompok dan mengandung sel-sel induk embrionik. Sel-sel diisolasi dari massa sel bagian dalam dan dikultur secara in vitro. Sel induk embrional dapat diarahkan menjadi semua jenis sel yang dijumpai pada organisme dewasa, seperti sel-sel darah, sel-sel otot, sel-sel hati, sel-sel ginjal, dan sel-sel lainnya	Pada embrio sel batang (embryonic stem cell), sel batang embrionik (ES) diperoleh dari sel-sel blastosis inner massa cel (ICM). Kemudian dicampur dengan DNA dengan metode DNA rekombinan. Sebagian ICM akan menyerap DNA dan ditranformasikan oleh materi genetik yang baru. Sel ES yang telah ditranformasikan ini kemudian akan diinjeksikan pada blastosis inang.
22	Hibridisasi Somatik	Hibridisasi somatik melalui fusi protoplasma digunakan untuk menggabungkan sifat lain dua spesies atau genus yang tidak dapat digabungkan secara seksual ataupun aseksual. Hal ini dapat dilakukan dengan cara menggabungkan seluruh genom dari spesies yang sama (intra-spesies), atau antarspesies dari genus yang sama (inter-spesies), atau antargenus dari satu famili (inter genus).	1.Mencari prosedur yang tepat untuk hibridisasi somatic. 2.Mencari prosedur yang tepat untuk mendapatkan hasil fusi yang mempunyai persentase tinggi dalam menghasilkan heterokarion binukleat 3.Seleksi heterokarion setelah fusi 4.Kultur heterokarion dengan persentase pembelahan sel dan regenerasi yang tinggi 5.Analisis karakterhibrid /sibriddan konstitusi genetic dari tanaman yang dihasilkan
23	Hibridisasi Sitoplasmik	Hibridisasi sitoplasmik melalui fusi protoplasma digunakan untuk menggabungkan sifat lain dua spesies atau genus yang tidak dapat digabungkan secara seksual ataupun aseksual. Hal ini dapat dilakukan dengan cara menggabungkan seluruh genom dari spesies yang sama (intra-spesies), atau antarspesies dari genus yang sama (inter-spesies), atau antargenus dari satu famili (inter genus).	6.      Menentukan bunga jantan/tetua 7.      Menyiapkan alat 8.      Mengidentifikasi bunga betina 9.      Menentukan waktu persilangan 10.  Mengisolasi 11.  Polinasi (pemindahan pollen ke kepala putik) 12.  Pembungkusan 13.  Pemberian label
24	Cybrid	Cybrid (cytoplasmid hybrid atau heteroplast), jika hanya sitoplasma yang mengalami fusi sedangkan informasi genetik dari salah satu induknya hilang.	1.Mencari prosedur yang tepat untuk isolasi protoplas 2.Mencari prosedur yang tepat untuk mendapatkan hasil fusi yang mempunyai persentase tinggi dalam menghasilkan heterokarion binukleat 3.Seleksi heterokarion setelah fusi 4.Kultur heterokarion dengan persentase pembelahan sel dan regenerasi yang tinggi 5.Analisis karakterhibrid /sibriddan konstitusi genetic dari tanaman yang dihasilkan
25	Elektroporasi	Elektroporasi merupakan metode yang menggunakan kejutan listrik untuk memperbesar pori-pori membran sel sehingga dapat meningkatkan permeabilitas membran. Untuk melakukan metode ini, sel harus terlebih dahulu ditumbuhkan pada media hingga mencapai masa di sekitar pertengahan fase log. Lalu sinyal elektrik akan menginduksi perbesaran pori-pori membran sehingga molekul yang berukuran kecil seperti DNA dapat masuk. Efisiensi dari metode ini berbanding terbalik dengan peningkatan ukuran plasmid.	Pada metode elektroporasi ini, sel tanaman yang akan menerima gen asing harus mengalami pelepasan dinding sel hingga menjadi protoplas (sel yang kehilangan dinding sel). Selanjutnya sel diberi kejutan listrik dengan voltasetinggi untuk membuka pori-pori membran sel tanaman sehingga DNA  asing dapat masuk ke dalam sel dan bersatu (terintegrasi) dengan DNA kromosom tanaman. Kemudian, dilakukan proses pengembalian dinding sel tanaman. Setelah proses transfer DNA selesai, dilakukan seleksi sel daun untuk mendapatkan sel yang berhasil disisipi gen asing. Hasil seleksi ditumbuhkan menjadi kalus (sekumpulan sel yang belum terdiferensiasi) hingga nantinya terbentuk akar dan tunas. Apabila telah terbentuk tanaman muda (plantlet), maka dapat dilakukan pemindahan ke tanah dan sifat baru tanaman dapat diamati. Metode elektroforasi telah diaplikasikan pada protoplas jagung dan berhasil mendapatkan tanaman jagung transgeniK tetapi tidak fertil.